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感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取

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感受态细胞的制备

—LB液体培养基:胰蛋白胨,1%(W/V);酵母提取物,0.5%(W/V);NaCl, 1%(W/V),用固体NaOH调节pH为7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制;—0.1mol/L CaCl2:称取1.47g CaCl2?2H20(Amresco分装)溶于100mL去离子水中,灭菌后存于4℃;

—离心管(50mL或80mL或100mL),灭菌;

—培养试管,灭菌;

—1mL枪头,灭菌;

—1mL加样枪;

—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;

—10mL量筒,灭菌;

—5mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;

—冰,离心管架;

—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。

1.接种空白大肠杆菌于3mL LB培养基中,37℃剧烈震荡培养过夜;

2.将已培养好的种子液转入100mL LB培养基中扩大培养至OD650=0.3后,将培养好的细菌置于冰上冷却10min;

3.4℃,4000rpm离心10min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干;

4.用40mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。冰上放置30min;

5.4℃,4000rpm离心10min收集细菌,倒出上清,再用4mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于4℃放置12~24h以增加其敏感性后使用。

6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100μL每管,再加入100μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。),于液氮或-70℃冰箱中存放。存于低温下的感受态细胞,一定不能融解。如果已经融解,应丢弃,而不能再冻结保存而继续使用。

注意事项:

1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。空白菌可以于平板上划线后,用Parafilm包好后存于4℃,也可将液体培养物存于4℃。但如果要长期保存,则应将细菌保存于50%的甘油中,存于-20℃或-70℃。当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃存放的液体培养物时,接种应迅速,不等解冻,立即从表面刮下一块冰后,将菌种迅速放回低温存放;

2.一般于3mL LB培养基中过夜培养12h后,菌体已很浓,可以进行扩大培养。于100mL培养基中培养2~3h后,即可达到对数生长期。但有时如果由于存放过久,或者已经过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时间会延长;

3.对OD值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取3mL测OD值。开始可以每30分钟检测一次,越到后面检测的时间就应该缩短;

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