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基因工程作业

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1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端,能发生载体自连,影响载体与外源DNA的连接效率,常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。

2、切口平移是指在的作用下,使

在酶切缓冲液中,一般需加入BSA,请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。

3、下列哪一种酶作用时需要引物(B)反转录酶在作用时需要DNA聚合酶,而后者需要引物 A、末端转移酶B、反转录酶C、 DNA 连接酶D、限制酶

4、下列DNA片段,最可能含有SstI 酶切位点的是(A)

A GGAGAGCCTCT B GAGCACATCT C CCCTGTGGGA

D ATCCTACATG E AACCTTGGAA

DNA连接酶的作用特点有哪些?

1、DNA 3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团(P)

2、需要能量、Mg2+

3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分

4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick

大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性,各有何利用价值。

1、5’— 3’聚合酶活性:以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链

2、3’— 5’外切酶活性:主要起校对作用

3、5’— 3’外切酶活性:从5’端降解DNA分子

何谓 Star activity?简述 Star activity 的影响因素及克服方法?

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。当条件改变时,许多酶的识别位点会改变,导致识别与切割序列的非特异性,称为星号(*)活性。

(1)高甘油含量(>5%, v/v);

(2) 限制性内切核酸酶用量过高(>100U/ugDNA);

(3)低离子浓度(<25 mmol/L);

(4)高pH(8.0以上);

(5)含有机溶剂,如DMSO(二甲基亚砜 ),乙醇等;

(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等)。

举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途

1、末端转移酶:同聚物加尾克隆DNA片段,再生酶切位点便于回收克隆片段,标记DNA片段的3’末端

2、多核苷酸激酶:催化5’羟基末端磷酸化便于DNA分子连接标记DNA或RNA的5’段

3、碱性磷酸酶:去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团,防止线性化的载体分子自我连接;与多核苷酸激酶共同作用,标记DNA5’末端

用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记,试简述其原理?

用3’—5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端制造出3’隐蔽端,再利用它的5’—3’聚合酶活性补平,并加入放射性标记的32P-dNTP。标记的dNTP逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸,因此叫做取代合成。

1、下列哪种克隆载体对外源 DNA 的装载量最大(B)

A、粘粒 B、酵母人工染色体(YAC) C、质粒 D、λ噬菌体

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